• Plant DNA extraction Kit 50preps

مراحل استخراج DNA از بافتهای گیاهی
لطفا قبل از شروع کار موارد کیت را به دقت مطالعه و مواد و شرایط لازم را فراهم آورید.

1.    تا 100 میلی گرم بافت تازه (یا حدود 30 میلی گرم وزن خشک) را به همراه ازت مایع درون هاون قرار داده و کاملا خرد کنید. بافت را که به صورت پودر درآمده است درون یک تیوب 1.5 استریل از پیش سرد شده در ازت مایع وارد کنید.
2.    پس از تبخیر ازت بلافاصله به تیوب به ترتیب 600 و 60 ماکرولیتر از بافر D1 و D2 اضافه کنید، با استفاده از ورتکس و یا پی پت کردن محلول را کاملا یکنواخت کنید.
3.    تیوب را به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار دهید.
4.    به تیوب 200 ماکرولیتر کلروفروم اضافه کنید. مخلوط حاصل را به
مدت 15 ثانیه به شدت تکان دهید یا ورتکس نمایید.
5.    تیوب را به مدت 5 دقیقه با دور 13000rpm دقیقه سانتریفیوژ نمایید.
6.    محلول رویی را به یک تیوب 1.5 استریل منتقل و رسوب حاصله را که شامل قطعات بافتی است دور بیاندازید.
7.    20 ماکرولیترRNase A  به تیوب افزوده و به مدت 10 دقیقه در دمای  37 درجه قرار دهید.
8.    به تیوب 300 ماکرولیتر اتانول مطلق اضافه کنید و با دور آهسته ورتکس و اسپین نمایید.
9.    محلول حاصله را به ستون ماک(MAK column) منتقل و به مدت 30 ثانیه با دور 10000rpm سانتریفیوژ کنید. محلول جمع شده در ویال پایینی را دور بریزید.
10.    مقدار 500 ماکرولیتر بافر D3 (از اضافه نمودن اتانول به بافر مطابق جدول اطمینان حاصل نمایید) را به ستون افزوده و به مدت 30 ثانیه با دور 10000rpm سانتریفیوژ کنید. محلول جمع شده در ویال پایینی را دور بریزید.
11.    مقدار 500 ماکرولیتر بافر D4 (از اضافه نمودن اتانول به بافر مطابق جدول اطمینان حاصل نمایید)  را به ستون افزوده و به مدت 30 ثانیه با دور rpm10000 سانتریفیوژ کنید. محلول جمع شده در ویال پایینی را دور بریزید.
12.    مرحله قبل را یک مرتبه دیگر تکرار نمایید.
13.    سپس ستون ماک را مجددا در داخل ویال خالی گذاشته و به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفیوژ کنید. این مرحله برای حذف باقیمانده بافر D4 از ستون بسیار ضروری است. سپس ویال پایینی را دور بیاندازید.
14.    ستون ماک را داخل یک تیوب 1.5 تمیز و استریل قرار دهید. مقدار 100- 50 ماکرولیتر از بافر Elution یا آب دیونیزه با دمای 70درجه را درست در مرکز ستون، بر روی فیلتر به آرامی بریزید. اجازه دهید ستون به مدت 2 دقیقه در دمای اتاق بماند، سپس به مدت 2 دقیقه با دور rpm10000 سانتریفیوژ نمایید.
15.    DNA استخراج شده را برای آزمایشات بعدی در برودت منفی 20 درجه نگهداری کنید.